GST Pull-Down



一.Pull down 的概念
      在Pull down实验中,带标签的诱饵蛋白能被特异结合该标签的固相亲和配基捕获,形成“次级亲和支持物”,用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。纯化产物洗脱后,经Western blot验证或LC-MS/MS,即可证明或鉴定与诱饵蛋白互作的蛋白。

二.Pull down实验方案设计
 1、构建含His或GST标签的诱饵蛋白原核表达载体;
 2、原核表达诱饵蛋白(AG贵宾厅采用自诱导培养基培养细菌,能有效降低包涵体的形成);
 3、细菌裂解液过柱,带标签的诱饵蛋白被固相化亲和配基捕获,产生“次级亲和支持物”;
 4、待测样品裂解液过柱孵育,与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物”吸附;
 5、清洗,离心,去除未结合的杂蛋白;
 6、洗脱,得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物;
 7、如要验证某蛋白X与诱饵蛋白互作,则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育,做Western blot验证即可;
 8、如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白,则需将6.所得的蛋白复合物做LC-MS/MS鉴定;

三.生物信息学分析
 GO注释统计
 GO注释统计
 Pathway分析Pathway分析                                                 
 Pathway分析

四.Pull down实验技术服务内容
 1、原核表达载体构建;
 2、融合蛋白的诱导表达与纯化;
 3、pull down捕获互作蛋白;
 4、Western blot验证或LC-MS/MS鉴定互作蛋白;
 5、数据检索、生物信息学分析;
 6、结果分析与报告整理。
 
五.订购pull down技术服务须知
        为保证pull down实验顺利进行,请告知您的研究背景和目的,并提供目的蛋白对应的mRNA序列或对应基因的NCBI登录号,及拟用的融合标签。
 
六.实验周期及费用:咨询本公司。

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